ΤΕΙ Κρήτης
Σχολή Τεχνολογίας Γεωπονίας
Ε.Π.Ε.Α.Ε.Κ 
Πρόγραμμα Συμπληρωματικής Εκπαίδευσης   "Βιολογική Γεωργία" Ενέργεια 3.4.γ

 

Βιολογική καταπολέμηση των ασθενειών των φυτών με στελέχη βακτηρίων, μυκήτων καθώς και με διάφορα εκχυλίσματα κομπόστ

Εισαγωγή
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

1.1 Ορισμός-Γενικά στοιχεία
1.2 Βιολογική καταπολέμηση των ασθενειών φυλλώματος στα θερμοκήπια
1.3 Προοπτικές
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

2.1 Η χρήση των υπερπαρασίτων στο βιολογικό έλεγχο των παθογόνων μικροοργανισμών των φυτών
2.2 Η συμπεριφορά των μυκήτων πάνω στις επιφάνειες του φύλλου. Διασπορά και βλάστηση
2.3 Προσβολή του φύλλου και δημιουργία Αποικιών
2.4 Απομονώσεις
2.5 Βιοδοκιμές
2.6 Μέθοδος “vitro
2.7 Αντικειμενοφόροι με Agar (Agar slides)
2.8 Μέθοδος “in vivo”. Δοκιμές σε φυτά κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες
2.9 Δοκιμές σε φυτά κάτω από μη ελεγχόμενες συνθήκες
2.10 Η σειρά των διαφόρων δοκιμών και συμπληρωματικά τεστ
Συμπεράσματα
Βιβλιογραφία

 

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

[Αρχή]

Η συλλογή των ανταγωνιστικών μικροοργανισμών στηρίζει συνολικά όλα τα βιολογικά προγράμματα. Αυτή η διαδικασία δίνει τεράστιους αριθμούς μεμονωμένων μικροοργανισμών, από τους οποίους πρέπει να επιλέξουμε μια τυπική μικροβιακή κοινότητα.

Δεν αποτελεί έκπληξη ότι πολλοί δυναμικοί μικροοργανισμοί που βοήθησαν την ιατρική ανακαλύφθηκαν τυχαία κατά τη διάρκεια συστηματικών ερευνών. Παρόλα αυτά υπάρχουν τρόποι που αυξάνουν τις πιθανότητες για ένα επιτυχές αποτέλεσμα. Πολλές από τις τεχνικές αυτές αναπτύχθηκαν από μικροβιολόγους που ασχολούνται με μικροοργανισμούς που βρίσκονται στο έδαφος, αλλά εφαρμόζονται σήμερα και στη μελέτη της μικροχλωρίδας της φυλλικής επιφάνειας των φυτών.

 

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1
ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΚΑΤΑΠΟΛΕΜΗΣΗ

1.1. Ορισμός-Γενικά στοιχεία

[Αρχή]

Η βιολογική καταπολέμηση αποτελεί σήμερα ένα από τα κύρια αντικείμενα επιστημονικών ερευνών στον τομέα της καταπολέμησης των ασθενειών. Σε ολόκληρο τον κόσμο γίνονται πειράματα με ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Αυτό μας δίνει ελπίδες ότι η βιολογική καταπολέμηση δεν θα είναι στο μέλλον κάτι το ακατόρθωτο και ότι σύντομα θα μπορεί να εξελιχθεί σε έναν εναλλακτικό και οικονομικό τρόπο καταπολέμησης των ασθενειών και δεν θα επιβαρύνουμε πλέον το περιβάλλον με φυτοφάρμακα.

Η χρησιμοποίηση μη παθογόνων μικροοργανισμών για τον έλεγχο μυκητολογικών ασθενειών άρχισε περίπου στις αρχές του 20ου αιώνα. Το 1921 ο Hartley χρησιμοποίησε ανταγωνιστές μύκητες για να καταπολεμήσει σήψεις σε σπορόφυτα κωνοφόρων. Το 1927 οι Millard και Teylor πειραματίστηκαν στην ασθένεια που προκαλείται από το παθογόνο Streptomyces scabies και απέδειξαν ότι η καταπολέμησή της συνδεόταν με τη δράση ανταγωνιστών μικροοργανισμών, και πιο συγκεκριμένα βακτηρίων που προήλθαν από χλωρή λίπανση. Το 1951 ο Wood εμβολίασε γερασμένα φύλλα μαρουλιού με ανταγωνιστές (Fusarium sp. Penicillium claviforme), για να εμποδίσει την αρχική εγκατάσταση του B.cineria (Dubos 1992).

Με τον καιρό όλο και περισσότερο αύξανε ο αριθμός των δημοσιεύσεων που ανέφεραν την καταπολέμηση ασθενειών με ανταγωνιστές μικροοργανισμούς. Πολύ λίγες, όμως, είναι οι περιπτώσεις που οι ανταγωνιστές μπορούν να εφαρμοστούν σε εμπορικό επίπεδο. Ως παράδειγμα αναφέρεται το Trichodex, ένα σκεύασμα του μύκητα Trichoderma harzianum, που παράγεται σε εμπορική κλίμακα από το 1985 από την εταιρεία Makteshim και βρέθηκε αποτελεσματικό για την καταπολέμηση της τεφρής σήψης. Ένα άλλο βιομυκητοκτόνο, που ονομάστηκε Mycostop και βασίστηκε στο μύκητα Streptomyces griseovirides, θα εγκριθεί για τον έλεγχο του μύκητα B. Cinerea στο μαρούλι στη Φιλανδία, μετά τις τοξικολογικές δοκιμές (Dubos 1992).

Στην πράξη χρησιμοποιούνται σκευάσματα με βάση τους μύκητες Trichoderma spp. T.harzianum, T.viride, όπως τα Trichotec, Trichodex-T39, Fior κλπ.

Μερικά από τα σκευάσματα αυτά περιέχουν στελέχη ανθεκτικά ή ανεκτικά σε μυκητοκτόνα, που χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση της τεφρής σήψης (benomyl, PCAF). Η ιδιότητα αυτή επιτρέπει τη συνεφαρμογή του βιολογικού σκευάσματος με ένα από τα μυκητοκτόνα αυτά (Μπούρμπος και Σκουντριδάκης 1993).

Ο πιο αποδεκτός ορισμός για τη βιολογική καταπολέμηση είναι αυτός που δόθηκε από τους Cook και Baker (1983) και αναφέρει τα εξής: “Βιολογική καταπολέμηση των παθογόνων των φυτών είναι η μείωση της ποσότητας του μολύσματος ή της νοσογόνου δράσης τους, που πραγματοποιείται από ή διαμέσου ενός ή περισσότερων οργανισμών, άλλων από τον άνθρωπο”.

Στους οργανισμούς αυτούς περιλαμβάνονται:

α) Ανταγωνιστικοί μικροοργανισμοί

-Ανταγωνισμός για τροφή και οξυγόνο. Με τον τρόπο αυτό δρα κατά της τεφρής σήψης ο μύκητας Trichoderma sp.

-Ανταγωνισμός με υπερπαρασιτισμό ή μυκητοπαρασιτισμό, δηλαδή με παρασιτικές ικανότητες ενός μύκητα σε κάποιον άλλο. Ως παράδειγμα αναφέρεται το είδος Hanstordia pulvinata, που είναι υπερπαράσιτο του Cladosporium fulvym στη ντομάτα.

Ανταγωνισμός με την παραγωγή χημικών ουσιών. Τα προϊόντα μεταβολισμού του ανταγωνιστή μπορούν να εμποδίσουν και πιο σπάνια να καταστρέψουν την ανάπτυξη του παθογόνου.

β) Άτομα ή πληθυσμοί που ανήκουν στο ίδιο παθογόνο είδος αλλά έχουν χαμηλή ή μηδαμινή μολυσματικότητα.

Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην ικανότητα που έχει ένα παράσιτο που έχει χάσει την παθογόνο του δύναμη να μπορεί να ανταγωνίζεται παθογόνες μορφές του. Τέτοιο παράδειγμα είναι το στέλεχος Κ84 του βακτηρίου 1 και 2 του A.arnefaciens.

γ) Ανθεκτικότητα του φυτού ξενιστή στην προσβολή του παθογόνου.

Η ανθεκτικότητα του φυτού στο παθογόνο μπορεί να προέρχεται είτε από κάποιο επίκτητο χαρακτηριστικό του είτε από κάποια γενετική βελτίωση. Η ανθεκτικότητα του ξενιστή επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες, όπως είναι η ποσότητα του μολύσματος, το περιβάλλον που αναπτύσσεται το φυτό κ.ά.

δ) Εκχυλίσματα από οργανικά υλικά (compost).

Είναι εκχυλίσματα από οργανικά υλικά, τα οποία έχουν προκαλέσει το επιστημονικό ενδιαφέρον εξαιτίας των εξαιρετικά μεγάλων πληθυσμών μικροοργανισμών που περιέχουν. Αυτοί οι πληθυσμοί μπορούν να βοηθήσουν στον έλεγχο παθογόνων οργανισμών.

1.2. Βιολογική καταπολέμηση των ασθενειών φυλλώματος στα θερμοκήπια.
[Αρχή]

Τα τελευταία χρόνια τόσο στις υπαίθριες όσο και στις θερμοκηπιακές καλλιέργειες παρατηρείται μια συνεχώς αυξανόμενη δυσκολία των παραγωγών να αντιμετωπίσουν τα προβλήματα που δημιουργούνται στις καλλιέργειες από εχθρούς και ασθένειες που προκαλούν σοβαρές ζημιές και επηρεάζουν σημαντικά τόσο την ποιότητα όσο και την παραγόμενη ποσότητα. Γι αυτό γίνονται προσπάθειες να εφαρμοστούν μέθοδοι βιολογικής καταπολέμησης που θα εφαρμόζονται είτε χωριστά είτε σε συνδυασμό με άλλα μέτρα καταπολέμησης. Σήμερα μερικές από τις τεχνικές βελτίωσης της παραγωγής που χρησιμοποιούνται στα θερμοκήπια αποτελούν και μια βιολογική μέθοδο αντιμετώπισης πολλών ασθενειών και ζιζανίων εδάφους. Η ηλιοαπολύμανση, δηλαδή η κάλυψη με πλαστικό φύλλο πολυαιθυλενίου, είναι μια τεχνική καταπολέμησης των παθογόνων του εδάφους. Η αποτελεσματικότητα της μεθόδου αυτής βασίζεται στην αθροιστική επίδραση της υγρής θερμότητας στους παθογόνους μικροοργανισμούς, τη δραστηριότητα των οποίων μειώνει, ενώ παράλληλα ευνοεί την ανάπτυξη της ανταγωνιστικής μικροχλωρίδας, που καταβάλλει τα ήδη εξασθενημένα παθογόνα. Η ηλιοαπολύμανση αποδείχτηκε εξαιρετικά αποτελεσματική για πολλές ασθένειες εδάφους των κηπευτικών υπό κάλυψη, όπως η καστανή σηψιρριζία της ντομάτας, η σήψη του λαιμού και των ριζών της ντομάτας, οι αδρομυκώσεις κ.ά. Η μέθοδος αυτή υπόσχεται πολλά στις περιοχές της Ν. Ελλάδας με μεγάλη ηλιοφάνεια και είναι ικανή να αποκαταστήσει τη διαταραγμένη μικροχλωρίδα από τα ισχυρά απολυμαντικά ευρέως φάσματος και να βελτιώσει την υφή και γονιμότητα των εδαφών.

Η φυτόμαζα εκτός από το ότι εμπλουτίζει το έδαφος με οργανική ουσία, ευνοεί την ανάπτυξη της σαπροφυτικής ανταγωνιστικής μικροχλωρίδας του εδάφους, που περιορίζει πολλές ασθένειες του εδάφους. Η ενσωμάτωση μετά από πολυτεμαχισμό των υπολειμμάτων της ντομάτας σε έδαφος θερμοκηπίου περιόρισε στο ελάχιστο τις ζημιές του σύμπλοκου της καστανής σηψιρριζίας (Μπούρμπος 1988).

Για την αντιμετώπιση του παθογόνου Sclerotinia sclerotiorum χρησιμοποιήθηκε κοπριά, η οποία τοποθετήθηκε στην επιφάνεια του εδάφους γιατί εκλύει CO2 και έχει βρεθεί ότι ο μύκητας είναι αρκετά ευαίσθητος στο CO2.

Σε πειράματα που έχουν γίνει στο Ινστιτούτο Προστασίας Φυτών Ηρακλείου έχει βρεθεί αποτελεσματικό για τον περιορισμό της επέκτασης των κηλίδων του ωιδίου (Sphaerotheca fuliginea) το υπερπαράσιτο Acremonium alternatum. Επίσης ο ψεκασμός με νερό σε συχνά χρονικά διαστήματα περιορίζει τις προσβολές από το ωίδιο (Μαλαθράκης 1991).

Ερευνητικές εργασίες που πραγματοποιούνται για τη βιολογική καταπολέμηση των ασθενειών του υπέργειου μέρους στα θερμοκήπια βρίσκονται σε εξέλιξη. Μερικές από τις ασθένειες που μελετώνται είναι:

α. Ωίδιο κολοκυνθοειδών. Εφαρμόζονται υπερπαράσιτα, εκχυλίσματα κομποστών.

β. Τεφρή σήψη. Εφαρμόζονται ανταγωνιστές, κυρίως μύκητες του γένους Trichoderma.

γ. Κλαδοσπορίωση. Εφαρμόζονται ανταγωνιστές μύκητες.

δ. Περονόσπορος της ντομάτας. Εφαρμόζονται εκχυλίσματα κομποστών.

ε. Περονόσπορος κολοκυνθοειδών. Εφαρμόζονται εκχυλίσματα κομποστών.

Η εφαρμογή των βιολογικών παραγόντων εναντίον των ασθενειών στα θερμοκήπια παρουσιάζει πλεονεκτήματα σε σχέση με τις υπαίθριες καλλιέργειες. Αυτά είναι:

α. Η εφαρμογή τους ελαττώνει την υψηλή μόνωση του περιβάλλοντος.

β. Επηρεάζεται λιγότερο από τις ακραίες τιμές των κλιματικών παραγόντων.

γ. Υπάρχουν περισσότερες δυνατότητες για τη ρύθμιση των κλιματικών παραγόντων στα επίπεδα που απαιτούνται για κάθε βιολογικό παράγοντα.

Παρόλο που πολλοί από τους τρόπους βιολογικής καταπολέμησης που έχουν δοκιμαστεί σε πειράματα ήταν αρκετά αποτελεσματικοί, στην πράξη χρησιμοποιούνται πολύ λίγοι. Αυτό συμβαίνει γιατί:

α. Οι βιολογικοί παράγοντες είναι συνήθως αποτελεσματικοί εναντίον μόνον μίας ασθένειας ο καθένας.

β. Δεν συνδυάζονται πάντα μεταξύ τους και με άλλες μεθόδους, όπως χημικά μέσα, για την καταπολέμηση πολλών ασθενειών συγχρόνως.

γ. Το κόστος συχνά είναι μεγαλύτερο από αυτό των συνηθισμένων μεθόδων.

δ. Ακόμα και όταν υπάρχουν οι καλύτερες συνθήκες η αποτελεσματικότητά τους είναι προς το παρόν κατώτερη από αυτή των άλλων μεθόδων.

ε. Στα θερμοκήπια που δεν υπάρχει κλιματισμός οι βιολογικοί παράγοντες δεν είναι αποτελεσματικοί γιατί χρειάζονται συγκεκριμένες συνθήκες περιβάλλοντος

1.3    Προοπτικές.
[Αρχή]

Σήμερα είναι πλέον επιβεβλημένη η χρησιμοποίηση των βιολογικών παραγόντων. Γι’ αυτό οι ερευνητές παγκοσμίως μέσα από διάφορα ερευνητικά προγράμματα προσπαθούν να βελτιώσουν τους ήδη υπάρχοντες βιολογικούς παράγοντες και να ανακαλύψουν νέους.

Για να αυξηθεί η χρησιμοποίηση αυτών των παραγόντων, πρέπει να αυξηθεί η αποτελεσματικότητά τους και να γίνει ισοδύναμη με εκείνη των συνηθισμένων μέτρων καταπολέμησης των ασθενειών (Papavisas 1986).

Για να πραγματοποιηθεί αυτός ο στόχος στα προσεχή έτη, η έρευνα πρέπει να συγκεντρώσει το ενδιαφέρον στα εξής σημεία:

α. Βελτίωση των γνώσεων όσον αφορά στην οικολογία των ανταγωνιστών και των παθογόνων.

β. Μελέτη του τόπου δράσης των διαφόρων ανταγωνιστών (αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους και αλληλεπιδράσεις με τα παθογόνα).

γ. Καλύτερη γνώση της χλωρίδας των διαφόρων ανταγωνιστών (το είδος και ο πληθυσμός των διαφόρων μικροοργανισμών στη φυλλόσφαιρα).

δ. Βελτίωση των ανταγωνιστών στελεχών.

ε. Βελτίωση της βιομηχανικής παραγωγής των ανταγωνιστών.

 

Οι προοπτικές για το μέλλον της βιολογικής καταπολέμησης γενικά, αλλά και ιδιαίτερα εναντίον της τεφρής σήψης, εξαρτώνται από ευρείας κλίμακας συνεργασία, η οποία θα πρέπει να περιλαμβάνει ερευνητικούς οργανισμούς και βιομηχανίες που ασχολούνται με τον τομέα προστασίας των καλλιεργειών, έτσι ώστε να μπορούν να τυποποιηθούν οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται μέχρι σήμερα.

Η συμμετοχή της βιολογικής καταπολέμησης δεν είναι ακόμη ουσιαστική. Πρέπει όμως άμεσα να συνειδητοποιήσουν όλοι την ανάγκη να υπάρξει ένα σύστημα προστασίας το οποίο να είναι οικονομικότερο και να σέβεται περισσότερο το περιβάλλον, πριν να είναι αργά (Dubos 1992).

 

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2      [Αρχή]

2.1. Η χρήση των υπερπαρασίτων στο βιολογικό έλεγχο των παθογόνων μικροοργανισμών των φυτών
[Αρχή]

Ο παρασιτισμός ενός μύκητα από άλλο μύκητα είναι κοινός σε όλα τα μεγάλα είδη μυκήτων, από τους απλούς ως τους πιο σύνθετους βασιδιομύκητες. Ο όρος παράσιτο χρησιμοποιείται για έναν οργανισμό που παρασιτεί σε βάρος ενός πρωταρχικού παράσιτου. Μερικά από τα παράσιτα που έχουν καταγραφεί στη φύση είναι εν δυνάμει χρήσιμα στο βιολογικό έλεγχο αυτών των σημαντικών παθογόνων οργανισμών. Ωστόσο λίγα πειράματα έχουν γίνει με σκοπό να χρησιμοποιηθούν παράσιτα στον έλεγχο κάποιας ασθένειας κάτω από πρακτικές συνθήκες στα θερμοκήπια και στα χωράφια. Το Cladosporium sp. έχει αναφερθεί ότι παρασιτεί σε πολλούς μύκητες, όπως αυτούς που προκαλούν τα ωίδια. Ψέκασαν ένα αιώρημα με σπόρια του μύκητα Cladosporium spongiosum πάνω σε φύλλα μουριάς που είχαν προσβληθεί από το μύκητα Phyllactinia quttata και παρατηρήθηκε κάποια μείωση της ασθένειας, ενώ παρατηρήθηκε ότι το Cladosporium cladosporioides παρασιτεί το μύκητα Erysiphe cichoracearum.

Δεν έχει αναφερθεί να υπάρχει κανένας περιβαλλοντολογικός κίνδυνος που να συνδέεται με τη χρήση αυτών των ευρέως χρησιμοποιούμενων υπερπαρασίτων των μυκήτων που προκαλούν τις ασθένειες ωίδιο και σκωρίαση. Ωστόσο είναι δύσκολο να εφαρμόσουμε στην πράξη τον τρόπο αυτό αντιμετώπισης μιας ασθένειας.

Τρεις διαφορετικοί οργανισμοί εμπλέκονται: Τα φυτά που φιλοξενούν παράσιτα, οι παθογόνοι οργανισμοί και ο υπερπαρασιτικός μύκητας. Ο καθένας επηρεάζεται από το περιβάλλον, τις καλλιεργητικές τεχνικές και τα προγράμματα καταπολέμησης των ασθενειών. Σε ένα πρόγραμμα ολοκληρωμένης καταπολέμησης μιας ασθένειας πολλές φορές δεν συμβιβάζεται η χρήση μυκητοκτόνου με τους παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης. Έτσι μεγαλύτερη έμφαση θα πρέπει να δοθεί στην εξεύρεση υπερπαρασίτων σημαντικών παθογόνων φυτικών οργανισμών.

Οι πιο πολλοί από τους παθογόνους οργανισμούς έχουν εκτενώς μελετηθεί και αρκετά πράγματα είναι γνωστά σχετικά με τις διαδικασίες μετάδοσής τους και την επιδημιολογία τους. Χρησιμοποιώντας αυτή τη γνώση προγράμματα ελέγχου έχουν αναπτυχθεί για να περιορίσουν τις οικονομικές απώλειες που μπορούν να προκαλέσουν.

Πολλοί μικροοργανισμοί βρίσκονται κανονικά πάνω ή ακόμη και μέσα σε ορισμένα φυτά, αλλά η ακριβής φύση των σχέσεων διατροφής με τους ζωντανούς ιστούς των φιλοξενούντων φυτών δεν έχει ακόμη βρεθεί. Οι μύκητες Cladosporium cladosporioides και Cladosporium herbarum βρίσκονται συνήθως στη φυλλική επιφάνεια πολλών ανώτερων φυτών. Τα δύο αυτά είδη είναι γνωστά ότι μπορούν να παράγουν κονίδια γρήγορα επάνω σε νεκρή φυλλική ύλη. Επιπλέον και τα δύο αυτά είδη δεν είναι παθογόνοι οργανισμοί πάνω σε ένα αριθμό φυτών.

2.2. Η συμπεριφορά των μυκήτων πάνω στις επιφάνειες του φύλλου. Διασπορά και βλάστηση.   [Αρχή]

Τα δύο είδη Cladosporium herbarum και Cladosporium cladosporoidoides παράγουν μεγάλους αριθμούς κονιδίων που διαδίδονται με τον αέρα. Ως εκ τούτου τα κονίδια τους συγκεντρώνονται στις εναέριες επιφάνειες των φυτών, όπου ειδικά πολλά στελέχη του γένους Cladosporium sp. έχουν παρατηρηθεί. Πολλά από τα κονίδια πάνω στις εναέριες επιφάνειες του φυτού σε φυσικές συνθήκες δεν βλαστάνουν. Αυτό το φαινόμενο ερευνήθηκε σε μια σειρά πειραμάτων, όπου κονίδια ψεκάστηκαν πάνω σε φύλλα φασολιάς (Dickinson&O’Dannell 1977). Κάτω από συνθήκες δωματίου βλάστησαν ορισμένα κονίδια του Cladosporium cladosporioides, αλλά συνέχισαν να βλαστάνουν κατά διαστήματα και επιπλέον κονίδια στη διάρκεια μιας περιόδου μερικών εβδομάδων. Τα υψηλότερα επίπεδα βλάστησης και ανάπτυξης των σπορίων επιτεύχθηκαν κρατώντας τα φυτά κάτω από συνθήκες συνεχούς πολύ υψηλής σχετικής υγρασίας (RH>97%). Σε αντίθεση η βλάστηση και ανάπτυξη των κονιδίων επηρεάστηκαν ελάχιστα από τη φυσιολογική κατάσταση του φύλλου, από το πλύσιμο των φύλλων πριν από τον ψεκασμό ή από τη προσθήκη σακχαρόζης μαζί με το διάλυμα σπορίων. “In vitro” μελέτης αυτού του φαινομένου έδειξαν ότι κονίδια και των δύο ειδών των Cladosporium sp. που επωάστηκαν σε νερό στους 25οC παρατηρήθηκε ότι βλάστησαν κατά τη διάρκεια 2-25 ημέρες (Dickinson&Bottomley 1980). Είναι ενδιαφέρον να υποθέσουμε ότι αυτός ο συγχρονισμός της βλάστησής του κονιδίου παρέχει ένα πλεονέκτημα σε αυτά τα είδη, καθώς μπορεί να βοηθήσει και να σιγουρέψει ότι θα υπάρξει διαθέσιμο τουλάχιστον ένα σπόριο για να αποικίσει το φυτό τη στιγμή που οι περιβαλλοντολογικές συνθήκες ή η κατάσταση των υποκείμενων ιστών το επιτρέψουν να βλαστήσει. Οι Webster και Dix (1960) ανέφεραν επίσης ότι το Cladosporium herbarum απαιτούσε ένα min σχετικής υγρασίας (RH) της τάξης του 89% προτού η βλάστηση των κονιδίων ξεκινήσει σε θερμοκρασία 20οC. Σημαντικές διαφοροποιήσεις στα δυο είδη παρατηρήθηκαν έσον αφορά στην ανταπόκριση του εύρους υγρασιών 89%-100% (Dickinson & Bottomley 1980). Η θερμοκρασία επηρέασε τα δύο είδη Cladosporium sp. διαφορετικά. Για τον μύκητα Cladosporium cladosporioides η βλάστηση ξεκίνησε σε θερμοκρασία (>30οC), ενώ για το μύκητα Cladosporium herbarum βλάστησαν τα κονίδια άριστα στους 25οC (Dickinson & Bottomley 1980). Ένας επιπλέον παράγοντας που ίσως επηρεάζει τη βλάστηση των κονιδίων αυτών των μυκήτων είναι η παρουσία μυτοστατικών ενώσεων που παράγονται από ορισμένα νεαρά φυτά (Dix 1974). Το French acid φάνηκε να είναι μια από τις ανασταλτικές αυτές ουσίες, όπως και άλλες ουσίες που ήταν επίσης παρούσες και δεν ταυτοποιήθηκαν. Το Cladosporium cladosporioides έχει γενικά μικρότερα κονίδια από αυτά του Cladosporium herbarum και άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης των υφών 10 οC - 25 οC, ενώ στο Cladosporium herbarum άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης των υφών ήταν οι 10οC (Dickinson & Bottomley 1980).

Κατά τη διάρκεια της περιόδου που τα κονίδια βρίσκονται στις εναέριες επιφάνειες του φυτού είναι εκτεθειμένα σε ένα συνεχώς μεταβαλλόμενο περιβάλλον, που χαρακτηρίζεται από τις συνεχείς διακυμάνσεις υγρασίας, θερμοκρασίας και ηλιακής ακτινοβολίας. Η χαμηλή υγρασία είναι πιθανόν ο πιο σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει τη βλάστηση και την ανάπτυξη. Πολλοί νηματόμορφοι μύκητες (Filamentus) δείχνουν μηχανισμούς προσαρμογής που τους επιτρέπουν να επιζήσουν σε μεγάλες περιόδους ξηρασίας. Πρόσφατα σχηματισμένες υφές του Cladosporium sp. είναι ικανές να ανέχονται τη χαμηλή υγρασία (όπως 5-40% RH) ή ακόμη την ξηρασία. Και στα δύο είδη οι υφές από μόνες τους αντέχουν σε συνθήκες πολύ χαμηλής σχετικής ξηρασίας, όταν όμως η υγρασία πλησίαζε τα όρια του κορεσμού (>90%) ξεκινούσαν την ανάπτυξή τους. Αυτό το φαινόμενο δεν ήταν εντελώς ομοιόμορφο, καθώς σε ορισμένες περιπτώσεις ενδιάμεσες υγρασίες είχαν ένα σημαντικό επιβλαβές αποτέλεσμα πάνω στη βιωσιμότητα των υφών. Επιπλέον, αν τα κονίδια είχαν βλαστήσει στους 20 οC και όχι στους 27 οC, τότε η χαμηλή υγρασία είχε επιβλαβή επίδραση σε αυτά. Προς το παρόν αυτό το φαινόμενο δεν έχει διερευνηθεί σε βάθος.

Ο ρόλος του περιβάλλοντος, επίσης, έχει σημασία. Και τα δύο είδη μπορούν να παράγουν υφές σκουρόχρωμες και με παχιά τοιχώματα, που τους επιτρέπουν να αντιστέκονται στην υπερβολική ακτινοβολία και θερμοκρασία. Ακόμη μπορούν να παράγουν μικροσκληρώτια αποτελούμενα από συσσωρεύσεις υφών σκουρόχρωμων με παχιά τοιχώματα, μορφές που παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιβίωση των ειδών (Pugh & Buckley 1971. Ruscoe 1971).

2.3. Προσβολή του φύλλου και δημιουργία Αποικιών      [Αρχή]

κεί όπου απομονώσεις των δύο μυκήτων ήταν ικανές να διεισδύσουν σε υγιείς ζωντανούς ιστούς του φυτού το πετύχαιναν κυρίως μέσω των στοματίων (O’Donnell & Dickinson 1980. Bottomley 1980). Πολλές υφές φάνηκαν να μεγαλώνουν κοντά στα στομάτια χωρίς να κάνουν κάποια προσπάθεια να διεισδύσουν στο φύλλο. Σε άλλες περιπτώσεις οι υφές φτάνοντας στο στομάτιο μεγάλωναν έως κάτω, μέσα στην κοιλότητα, χωρίς να σχηματίζουν κάποια φανερή δομή. Ένα αξιοσημείωτο χαρακτηριστικό αυτών των μυκήτων ήταν ο αργός βαθμός στον οποίο διείσδυσαν στα φύλλα του γαλλικού φασολιού (French bean) (O’Donnell & Dickinson 1980). To Cladosporium cladosporioides χρειάστηκε περίπου 7-14 ημέρες για να αποικίσει στις υποστοματικές κοιλότητες. Αρκετές απομονώσεις του Cladosporium cladosporioides απέτυχαν να διεισδύσουν ευθέως στα επιδερμικά κύτταρα του σιταριού. Σαν ένα προκαταρκτικό στάδιο ανέπτυξαν μικρά εξογκώματα στα άκρα των υφών τους. Στο επόμενο στάδιο της διείσδυσης συνάντησε μια ξαφνική αντίδραση από το φυτό που περιγράφτηκε ως αντίδραση Halo και Papilla (Ride & Pearce 1979).

Και τα δύο είδη Cladosporium cladosporioides και Cladosporium herbarum επίσης διείσδυσαν πιο συχνά μέσω των στομάτων των φύλλων της κορυφής του σιταριού, από ότι σε σχέση με αυτά που ήταν κοντά στον κολεό του φύλλου. Άλλες εστίες μόλυνσης που αυτοί οι μύκητες εκμεταλλεύτηκαν ήταν οι φυσικές και τεχνικές πληγές. Τα Cladosporium sp. παρατηρήθηκαν να αποικίζουν κανονικά πράσινους ιστούς φύλλων δημητριακών που είχαν πάθει ζημιά από την κίνηση του ανέμου ή από προσβολή από έντομα.

Οι δύο μύκητες (Cladosporium sp. και Alternaria alternata) αποικίζουν τα έλυτρα των δημητριακών και αποτελούν τους κύριους μύκητες που προκαλούν την καπνιά (Sooty Mould) (Dickinson 1981). Έχουν παρουσιαστεί στοιχεία ότι δεν συμπεριφέρονται σαν Sooty Mould και αυτό στηρίζεται στο γεγονός ότι δεν σχηματίζουν εκτεταμένες επιφυτικές θολές επιφάνειες μυκηλίου, αλλά ότι αυτή η εντύπωση της καπνιάς οφείλεται στους κονιδιοφόρους και τα κονίδια. Η προσβολή στα έλυτρα μπορεί να γίνει μέσω των κορυφών των ελύτρων που γηράσκουν ή οι μύκητες ίσως αρχίσουν να αναπτύσσονται πάνω στους ανθήρες που ανοίγουν και οι οποίοι μπορούν να παρέχουν επαρκή θρεπτικά συστατικά μέχρι να αρχίσει η έκπτιξη και η προσβολή των ελύτρων. Επιπλέον σχόλιο πάνω στην αναφορά του μύκητα σαν μύκητας της καπνιάς έγινε από τον Friend (1965), ο οποίος ανακάλυψε ότι το Cladosporium herbarum είναι ένας από τους πιο συνηθισμένους μύκητες πάνω σε έναν αριθμό φυτών που παρουσιάζουν καπνιά.

2.4. Απομονώσεις       [Αρχή]

Πρώτα από όλα οι μικροοργανισμοί πρέπει να απομονωθούν. Οι τομείς της στρατηγικής που θα ακολουθηθούν, οι πηγές, η ανάπτυξη και η επιβίωση του μύκητα θα συζητηθούν παρακάτω. Διάφορες απόψεις αναφέρονται για τη δειγματοληψία και λήψη των μικροοργανισμών από τα φύλλα ή άλλα σύνθετα υποστρώματα.

Είναι ιδιαίτερα χρήσιμο κατά τη διαδικασία συλλογής των βακτηρίων και μυκήτων να καταγράφονται λεπτομέρειες, όπως ημέρα συλλογής, αφθονία των βακτηρίων (συγκέντρωση), μέσο απομόνωσης και μέθοδος διατήρησης.

Η πρώτη σημαντική ερώτηση είναι κατά πόσο πρέπει να απομονωθούν αντιπροσωπευτικά είδη από ολόκληρη τη μικροβιακή κοινότητα ή είδη με εξειδικευμένες απαιτήσεις.

Α. Στην πρώτη περίπτωση η απομόνωση πρέπει να γίνει σε υποστρώματα κατάλληλα για νηματόμορφους μύκητες, ζύμες και βακτήρια.

Β. Στη δεύτερη περίπτωση η διαδικασία επιλογής βασίζεται στα θρεπτικά χαρακτηριστικά των μικροοργανισμών με τη χρήση κάποιου συστατικού που υποβοηθεί την ανάπτυξη συγκεκριμένων μικροοργανισμών (χιτίνη, agar για τους ακτινομύκητες).

Γ. Μια επιλογή είναι να καλλιεργήσουμε στο ίδιο τρυβλίο με agar το παθογόνο και τους υποψήφιους ανταγωνιστές και μετά να επιλέξουμε τους μικροοργανισμούς που δείχνουν ανταγωνιστική δράση, όπως αυτό κρίνεται από ζώνες παρεμπόδισης. Είναι σκόπιμο να αναφερθεί ότι αυτή η προσέγγιση συνδυάζει την απομόνωση μαζί με τις βιοδοκιμές μέχρι το σημείο να μπορούμε να έχουμε αξιόπιστα αποτελέσματα, τα οποία θα χρησιμοποιηθούν μελλοντικά.

Δ. Μερικοί ερευνητές προτιμούν να δοκιμάζουν μικροοργανισμούς με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά, όπως την παρουσία τους στην φυλλική επιφάνεια, καλή ανάπτυξη, σταθερότητα και ικανότητα σποροποίησης σε καλλιέργεια in vitro, ιδίως όταν ξέρουμε ότι τα μέλη των γενών ή των ειδών αυτών είναι ανταγωνιστές ή όταν μορφολογικά ή φυσιολογικά χαρακτηριστικά διευκολύνουν στον αγρό την ικανότητα επιβίωσης αυτών των ανταγωνιστών κάτω από αντίξοες πολλές φορές συνθήκες. Είναι γενικά παραδεκτό ότι αυτή η προσέγγιση συλλογής δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται συχνά, εκτός αν το φυτό αποδειχθεί από προηγούμενη ερευνητική εμπειρία και μόνο όταν αυτή η ανταγωνιστική ιδιότητα προσανατολίζεται σε μια συγκεκριμένη ομάδα μικροοργανισμών. Ακόμα αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια αξιόλογη πρόβλεψη για τον ανταγωνισμό των μικροοργανισμών στον αγρό. Στην πράξη καμιά από τις παραπάνω υποθέσεις δεν έχει επιβεβαιωθεί στη μικροβιολογική μελέτη της φυλλικής επιφάνειας. Άλλο ένα ερώτημα εξίσου σημαντικό είναι πως θα “καθαρίσουμε” και θα “αποθηκεύσουμε” τους μικροοργανισμούς, “άγρια στελέχη”, που έχουν απομονωθεί από την φυλλική επιφάνεια. Αυτό είναι ένα πρόβλημα που πρέπει να λύσουμε όσο το δυνατόν καλύτερα, γιατί πρέπει η καλλιέργεια να παραμείνει γενετικά αμετάβλητη.

Τα βακτήρια και οι ζύμες πρέπει να περάσουν από διαδοχικές καλλιέργειες (τρεις ως τέσσερις φορές “single colony technique”) με απομόνωση μεμονωμένων αποικιών. Επιπρόσθετα επιμελής εξέταση εξασφαλίζει την πιθανότητα “καθαρών καλλιεργειών”.

Οι ακτινομύκητες “καθαρίζονται” με διαδοχικές αραιώσεις, το αιώρημα των οποίων απλώνεται σε τρυβλία. Οι μύκητες οι οποίοι θα επιλεγούν πρέπει να προέρχονται από μονόσπορη καλλιέργεια ή κομμάτια υφής και όχι από μαζικές μεταφυτεύσεις.

Η κατάλληλη διατήρηση είναι ουσιαστική για την επιβίωση, τη διατήρηση των λειτουργικών ιδιοτήτων και τη γενετική σταθερότητα όλων των υποψήφιων ανταγωνιστών. Οι πιο κατάλληλες μέθοδοι για μακροχρόνια διατήρηση είναι η αποθήκευση σε υγρό άζωτο, η αποθήκευση στους -70οC σε γλυκερόλη ή διμεθυλική σουλφοξίδη ή άλλα κρυοπροστατευτικά ή ακόμη για μερικούς μύκητες πάγωμα (κατάψυξη) κάτω από λάδι στο ψυγείο.

Κατά τη διαδικασία των πειραμάτων οι καλλιέργειες μικροοργανισμών που χρησιμοποιούνται μπορούν να αποθηκευτούν στους 4 οC, αλλά πάντα πρέπει περιοδικά να εξετάζουμε και να συγκρίνουμε τις καλλιέργειες αυτές με τι αρχικές καθαρές και διατηρημένες καλλιέργειες.

2.5. Βιοδοκιμές     [Αρχή]

Για αποτελεσματική βιολογική καταπολέμηση οι ανταγωνιστές πρέπει να έχουν ορισμένες ιδιότητες, όπως ανταγωνιστική ικανότητα και ικανότητα για την επιβίωσή τους στο οικοσύστημα, όπως αυτές απορρέουν από μια σειρά γεγονότων. Οι συγκεκριμένες τεχνικές που εξηγούνται παρακάτω εξετάζουν διάφορες ιδιότητες και διαφορετικούς βαθμούς αποτελεσματικότητας.

Όλες οι βιοδοκιμές με ανταγωνιστές βασίζονται στην παρακάτω αρχή: οι υποψήφιοι μικροοργανισμοί αλληλεπιδρούν με το παθογόνο ή μειώνουν την προσβολή του στο φυτό. Με τον όρο αλληλεπίδραση (παρέμβαση) εννοούμε μια ορισμένη φάση, όπως μερική αναστολή ή θανάτωση του παθογόνου, που μπορεί να εξεταστεί στο εργαστήριο με: α. μακροσκοπική εξέταση κολλητικής ταινίας που έχει χρησιμοποιηθεί για αποτυπώσεις κατευθείαν από τα φύλλα, β. σε υποστρώματα με βάση το Agar και γ. σε αντικειμενοφόρους πλάκες με τη χρήση μικροσκοπίου.

Η αποτελεσματικότητα ως βιολογικός παράγοντας μπορεί να εκτιμηθεί με τη μείωση της προσβολής ή με την καταγραφή της έντασης, όπως αριθμός κηλίδων και εμβαδόν των κηλίδων, ή με μέτρηση του εμβαδού χαμένης φυλλικής επιφάνειας ορισμένης φυτικής βιομάζας. Η “in vivo” δοκιμές γίνονται με φυτά σε θαλάμους ανάπτυξης.

2.6. Μέθοδος “in vitro”      [Αρχή]

Τα πειράματα σε τρυβλία με άγαρ “στερεά υποστρώματα” ή παραλλαγές αυτού του τύπου δοκιμής ή τοπική εμφύτευση σε τρυβλία, είναι οι πιο κοινές μέθοδοι.

Στις πρώτες ημέρες της έρευνας πάνω στις αντιβιοτικές ουσίες εκατομμύρια από μικροοργανισμούς, κυρίως ακτινομύκητες εδάφους, δοκιμάστηκαν με αυτές τις τεχνικές.

Έτσι πολλοί φυτοπαθολόγοι και σήμερα συνεχίζουν να χρησιμοποιούν αυτή την τεχνική, για να δοκιμάσουν ολόκληρους πληθυσμούς ή για να εκτιμήσουν μεμονωμένους ανταγωνιστές. Αν και αυτές οι παραλλαγές της προαναφερόμενης δοκιμής Β.Π. (βιολογικοί παράγοντες) σε τρυβλία είναι πολυάριθμες, τόσο στη μικροβιολογία εδάφους όσο και στην έρευνα της βιολογικής καταπολέμησης φυλλικής επιφάνειας, γεγονός είναι ότι οι συνήθως αποτελεσματικοί Β.Π. στο εργαστήριο δεν αποδεικνύονται καθόλου αποτελεσματικοί στον αγρό.

Συνήθως οργανισμοί που δείχνουν ανταγωνισμό σε τεστ με τρυβλία δεν ελέγχουν την ασθένεια όταν εφαρμόζονται στα φυτά. Αντιθέτως λιγότερο κοινό είναι να υπάρχουν ανταγωνιστές που είναι αποτελεσματικοί στο να ελέγχουν την προσβολή από κάποιο παθογόνο στον αγρό (π.χ. λευκές ζύμες), ενώ μπορεί να μην εμφανίζουν αυτή τους την ιδιότητα στην καλλιέργεια στο τρυβλίο. Έτσι μπορεί τέτοιοι ανταγωνιστές να απορριφθούν, αν η δοκιμή σε τρυβλία με Agar αποτελεί το μοναδικό κριτήριο αξιολόγησης.

Γιατί τα τεστ σε τρυβλία στο εργαστήριο “in vitro” παραμένουν σε ισχύ; Το παράδοξο είναι ότι χρησιμοποιείται παγκοσμίως, ενώ συνοδεύεται από αντικρουόμενες απόψεις.

Υπάρχουν πολλά θετικά στοιχεία που παρέχουν οι βιοδοκιμές στη μικροβιολογία. Αυτές έγιναν παγκοσμίως αποδεκτές, εξαιτίας των ορατών αποτελεσμάτων που παρείχαν σχετικά γρήγορα.

Ιστορικά οι ζώνες παρεμπόδισης έδωσαν ελπίδες ότι οι μικροοργανισμοί που μελετήθηκαν στη φυτοπαθολογία (όπως το Penicillium notatum και το Penicillium chrysouypnum) θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν και στην ιατρική.

Αυτές οι δοκιμές είναι εύκολες στην εκτέλεση και στην ερμηνεία τους και τυπικά μπορούν να διεξαχθούν μέσα σε λίγες ημέρες. Οι τύποι των αλληλεπιδράσεων περιλαμβάνουν την αναστολή του παθογόνου από τους ανταγωνιστές, η οποία μπορεί να παρατηρηθεί κατευθείαν στην καλλιέργεια. Η σύσταση των υποστρωμάτων και οι συνθήκες διεξαγωγής των πειραμάτων μπορούν να προσαρμοστούν εύκολα. Έτσι οι αλληλεπιδράσεις ανταγωνιστή-παθογόνου μπορούν να μελετηθούν κάτω από διάφορες συνθήκες.

Υπάρχουν τρεις λόγοι για να περιλάβουμε τις “in vitro” δοκιμές στη διαδικασία επιλογής βιολογικής παραγόντων. Ο πρώτος λόγος επισημάνθηκε από τους Baker και Cook και επισημαίνει ότι η “in vitro” τεχνική μπορεί να διαχωριστεί και προπορεύεται στην επιλογή υποψηφίων ανταγωνιστών. Δεύτερον, οι δοκιμές σε τρυβλία με agar δίνουν στοιχεία για τον τρόπο δράσης των ανταγωνιστών και των παραμέτρων που μπορούμε να εξετάσουμε περαιτέρω. Τρίτον, οι δοκιμές σε τρυβλία με agar είναι ένας σύντομος βιολογικός τρόπος για τη σύγκριση απομονώσεων.

Άλλη μέθοδος (η οποία δεν έχει διερευνηθεί, αλλά η οποία θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί) είναι η χρήση της μεθόδου των τρυβλίων με agar, για να επιλέξουμε στελέχη με βάση την ικανότητά τους να δημιουργούν αποικίες, αφού προηγουμένως έχει αποδειχτεί η ανταγωνιστική τους ικανότητα.

 2.7. Αντικειμενοφόροι με Agar (Agar slides)     [Αρχή]

Μικροσκοπικός προσδιορισμός ανταγωνισμού έναντι σε παθογόνους μύκητες μπορεί να γίνει σε καθαρές αντικειμενοφόρους μικροσκοπίου καλυμμένες με λεπτή στρώση agar ή agaroses. Οι επενδυμένοι αντικειμενοφόροι ψεκάζονται με αιώρημα σπορίων του ανταγωνιστή και σπορίων του παθογόνου και επωάζονται σε υγρούς θαλάμους για 2-3 ημέρες. Στη συνέχεια χρώζονται και καταγράφονται τα αποτελέσματα της βλάστησης και η μορφολογία των βλαστικών υφών του παθογόνου.

Αυτή είναι βασικά μικροσκοπική παραλλαγή της δοκιμής με τρυβλία με agar, αλλά είναι γρηγορότερη και υποθετικά ανώτερη επειδή είναι πιο κοντά στις συνθήκες έλλειψης θρεπτικών στοιχείων, φαινόμενο που λαμβάνει χώρα μόνο στη φυλλική επιφάνεια.

Ένα ερώτημα που γεννιέται είναι πόσο κοντά βρίσκονται οι τεχνικές αυτές (αντικειμενοφόροι με agar) συγκρινόμενες με φαινόμενα τα οποία μπορούν να εκτιμηθούν με τη μέθοδο αποτύπωσης από τη φυλλική επιφάνεια με τη χρήση ταινίας και πόσο μπορούν να συσχετιστούν αυτές με βιοδοκιμές που μετρούν την αποτελεσματικότητα κατά της ασθένειας.

Σε πειράματα που έγιναν για τη βιολογική καταπολέμηση του μύκητα V. inaeguales με τέσσερις βασικούς επιλεγμένους ανταγωνιστές (μύκητες, ζύμες, ακτινομύκητες και βακτήρια) βρέθηκε ότι η μέθοδος της αντικειμενοφόρου καλυμμένης με agarose έδωσε παρόμοια αποτελέσματα με πειράματα που έγινα σε φύλλα “in situ” και στα οποία εκτιμήθηκε η προσβολή με τη μέθοδο της ταινίας. Παρατηρήθηκε μείωση της βλάστησης 83% πάνω στις αντικειμενοφόρους και 72% πάνω στη φυλλική επιφάνεια.

Η μέθοδος της αντικειμενοφόρου παρέχει τις ίδιες περίπου πληροφορίες όπως και οι δοκιμές σε τρυβλία. Επίσης τα δεδομένα των αντικειμενοφόρων είναι πιο λεπτομερή, αναλύονται εύκολα, είναι πιο κατατοπιστικά σε κάποιες περιπτώσεις και για τη διεξαγωγή τους απαιτούν λιγότερο χρόνο.

Τα τρυβλία με agar και οι αντικειμενοφόροι μα agar πρέπει πάντα να περιλαμβάνονται σε ένα πρόγραμμα βιοδοκιμών.

Και οι δύο αυτές τεχνικές μπορούν να συνδυαστούν σε μία χρησιμοποιώντας κατατεμνημένα τρυβλία Petri για να επιτύχουμε για παράδειγμα διαφορετικές θρεπτικές συνθήκες. Επιπρόσθετα τοποθετώντας αποστειρωμένες καλυπτρίδες πάνω στο εμβολιασμένο υπόστρωμα μπορούμε να έχουμε άμεση λεπτομερή μικροσκοπική εξέταση με τη χρήση χρωστικής ή φίλτρου μικροσκοπίου

2.8. Μέθοδος “in vivo”. Δοκιμές σε φυτά κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες  [Αρχή]

Πολλές δοκιμές στην επιφάνεια των φύλλων διαφόρων φυτών κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες παρουσιάζουν ιδιαίτερη σημασία στη βιολογική καταπολέμηση.

Διάφορα μικρόβια που δεν παρουσιάζουν ιδιαίτερη σημασία όσον αφορά στη παθογένεση σε πειράματα με Agar, στο εργαστήριο μπορούν να δώσουν αξιόλογα αποτελέσματα με αυτή τη μέθοδο. Ειδικότερα διάφοροι μικροοργανισμοί μπορούν να εξαλειφθούν από περαιτέρω πειράματα, αν δεν εμφανίζουν επαρκή καταπολέμηση στη φυλλική επιφάνεια διαφόρων φυτών κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες ή το αντίθετο.

Σε αυτό το στάδιο των πειραμάτων η προσπάθεια πρέπει να επικεντρωθεί στην αναπαραγωγή και εφαρμογή μεγάλης διάρκειας πειραμάτων με ελάχιστη διαφοροποίηση. Όπως καταλαβαίνουμε, αυτό είναι πολύ δύσκολο να επιτευχθεί, εξαρτώμενο φυσικά από τη μέθοδο του πειράματος.

Για παράδειγμα πολλά πειράματα στηρίζονται στη γενετική ποικιλομορφία επικονιαζόμενων σποροφύτων διαφόρων φυτών. Έτσι από ανάμικτους σπόρους διαλέγονται αυτοί οι οποίοι θα ελεγχθούν και θα παράγουν μονόκλινες σειρές σποροφύτων από τις οποίες θα διαλέξουμε τις πιο καθαρές. Κλώνοι από οφθαλμούς ή μοσχεύματα μπορεί επίσης να εφαρμοστούν, αλλά τα φυτά τα οποία θα παραχθούν θα είναι εμφανώς μεγαλύτερα από τα φυτά τα οποία θα παραχθούν από σπόρους.

Έτσι το περιβάλλον ανάπτυξης των φυτών, διαφόρων μικροοργανισμών, ανταγωνιστών γίνεται μεγαλύτερο, με αποτέλεσμα να μπορεί να ελεχθεί αποτελεσματικά η μόλυνση, κατατάσσοντας αυτή τη μέθοδο πολύ δαπανηρή σε χρόνο και πόρους.

Μια ενθαρρυντική προοπτική για εύκολη διεξαγωγή των πειραμάτων και εξοικονόμηση χρόνου είναι ο πολλαπλασιασμός ριζών φυτών με ιστοκαλλιέργεια, δίνοντας την καλύτερη λύση.

Το πρόβλημα διακύμανσης του γενετικού υλικού από τον συνεχή πολλαπλασιασμό των φυτών μπορεί να ξεπεραστεί στο μεγαλύτερο μέρος του από συγκριτικές μεταχειρίσεις σε μεμονωμένα φύλλα. Για παράδειγμα σε πολλές έρευνες κηλίδες μόλυνσης μπορούν να μελετηθούν στην επάνω επιφάνεια εκπτυσσώμενων ακραίων φύλλων μήκους 6-10 mm, τα οποία εμβολιάζονται 2 ως 4 (κατά ζεύγη) με διάλυμα το οποίο περιέχει μια ποσότητα ανταγωνιστή και το μύκητα V. Inaequalis από την αντίθετη πλευρά του φύλλου.

Οι ανταγωνιστές οι οποίοι δοκιμάζονται έχουν μια σχετική ικανότητα για κάθε μικρόβιο να περιορίζουν τις κηλίδες μόλυνσης με μέτρο σύγκρισης το μήκος της κηλίδας, με μια σκάλα από το 0 ως το 5, όπου 0=καθόλου μόλυνση και 5=πλήρης μόλυνση, όταν ο V. Inaequalis (παθογόνο) τοποθετήθηκε μόνος του.

Επειδή υπάρχουν βιολογικές διαφοροποιήσεις όσον αφορά στα φύλλα της βάσης και τα φύλλα της κορυφής, οι σταγόνες σε αυτές τις δύο διαφορετικές περιοχές αναλύονται σε διαφορετικά πειράματα.

Ένα άλλο προσόν του εμβολιασμού με σταγόνες είναι ότι αποφεύγεται κάθε επιπλοκή όσον αφορά στη διακύμανση του αποτελέσματος που λαμβάνει χώρα όταν το εμβόλιο εφαρμόζεται με ψεκασμό πάνω στο φυτό.

Δύο άλλες προσεγγίσεις συμπληρώνουν τις δοκιμές με σταγόνες. Πρώτον τα σπορόφυτα μπορούν να ψεκαστούν με αιώρημα του παθογόνου ή με αιώρημα του παθογόνου με τον ανταγωνιστή, δίνοντας ένα μέτρο σύγκρισης της έντασης της ασθένειας.

Δεύτερον, εάν είναι δυνατόν, μπορεί να γίνει η συσχέτιση μεταξύ κηλίδων ανάσχεσης και καταστολής με την παραγωγή κονιδίων του παθογόνου μύκητα, δίνοντας μια σχετική εικόνα για την ένταση της μόλυνσης.

Έτσι, αφού ψεκαστούν τα κατώτερα φύλλα των φυτών με το εμβόλιο και το μύκητα, αφήνονται σε κατάλληλες συνθήκες να αναπτυχθεί η ασθένεια.

Μετά κάθε φυτό ζυγίζεται και πλένεται με διάλυμα το οποίο περιέχει 0,01% αποκολλητικό TWEEN 20, το οποίο χρειάζεται για να αποκολληθούν τα κονίδια του μύκητα.

Τα κονίδια από το αιώρημα των ξεπλυμένων φύλλων συγκεντρώνεται με φυγοκέντριση σε χαμηλές στρόφες και μετριούνται με τη βοήθεια αιματοκυστόμετρου ( η εκτίμηση μπορεί επίσης να γίνει με σπεκτροφωτόμετρο ή ακόμη και με ηλεκτρονικό μετρητή). Έτσι η ανταγωνιστική ικανότητα επιβεβαιώνεται με τη μέτρηση της παραγωγής των κονιδίων ανά γραμμάριο βάρους του φύλλου. Αυτή η συσχέτιση γίνεται σε κάθε πείραμα.

2.9. Δοκιμές σε φυτά κάτω από μη ελεγχόμενες συνθήκες      [Αρχή]

Η τελική δοκιμή σε αυτή τη διαδικασία πειραμάτων είναι το πως ο ανταγωνιστής δρα όταν εφαρμόζεται σε φυσικό περιβάλλον (φυσική μικροβιολογική κοινότητα), το οποίο περιλαμβάνει φυσικά και αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες. Δεν προκαλεί έκπληξη ότι πολλοί ανταγωνιστές δεν περνούν την τελική αυτή δοκιμή.

Επειδή αυτές οι δοκιμές γίνονται κάτω από μη ελεγχόμενες συνθήκες, οι παρατηρήσεις και τα αποτελέσματα αυτών των δοκιμών πρέπει να διαχωρίζονται από τις προηγούμενες δοκιμές. Η διακύμανση των αποτελεσμάτων είναι ένα σημαντικό πρόβλημα που λαμβάνει χώρα στις δοκιμές στο χωράφι, το οποίο μπορεί εξαλειφθεί αν οι δοκιμές συνεχιστούν για διαφορετικές χρονικές περιόδους και τοποθεσίες, προτού κατασταλάξουμε σε ένα ουσιαστικό αποτέλεσμα.

Αν ο ανταγωνιστής είναι αφανής μέλος της κοινότητας (της φυλλικής επιφάνειας), εφαρμοσμένος σε μεγάλους πληθυσμούς μπορεί να χαράξει μια καλή ανταγωνιστική πορεία για περαιτέρω γενετική μελέτη. Ακόμη, αν ένας διακεκριμένος ανταγωνιστής που έχει δείξει καλή ανταγωνιστική ικανότητα, εφαρμοστεί κατά πληθυσμούς επάνω στη φυλλική επιφάνεια, μπορεί να αποτελέσει βάση (γενετικό υλικό) για περαιτέρω πειράματα. Αυτή η μέθοδος μπορεί να συμπληρωθεί με παρατηρήσεις με τη βοήθεια ηλεκτρονικού μικροσκοπίου (scanning), δίνοντας διάφορες πληροφορίες (αριθμός σπόρων, παραγωγή μυκηλίου), που βοηθούν στην κατανόηση της ανάπτυξης της ασθένειας ή της καταστολής της.

Ανταγωνιστές οι οποίοι αποτυγχάνουν σε αυτή τη τελική δοκιμή δεν είναι απαραίτητα ακατάλληλοι για καταστολή της ασθένειας και δεν πρέπει να καταστρέφονται.

Η αποτυχία της μεθόδου “in vitro” μπορεί να οφείλεται στο γρήγορο θάνατο της φυλλικής επιφάνειας. Αυτό το πρόβλημα μπορεί να εξαλειφθεί με διάφορους χειρισμούς που προστατεύουν το μόλυσμα από το θάνατο, επιτυγχάνοντας την προσκόλλησή του στη φυλλική επιφάνεια (μερικοί μικροοργανισμοί δημιουργούν δεσμούς με τους οποίους προσκολλούνται στη φυλλική επιφάνεια).

Ακόμη και αν ο ανταγωνιστής δεν έχει προσκολληθεί στη φυλλική επιφάνεια, παραμένει ένας πολύτιμος δότης από γόνους, μετατρέποντας τα είδη που υπάρχουν στη φυλλική επιφάνεια σε δυναμικές αποικίες, λειτουργώντας ως ανταγωνιστές.

Τέλος, οι δοκιμές “in vivo” παρέχουν πολλές πληροφορίες και ιδιότητες για τους ανταγωνιστές, όπως η δράση και η επιβίωσή τους στη φυλλική επιφάνεια (αν ο ανταγωνιστής επιβιώσει σε ένα μη φυσικό προς αυτόν περιβάλλον, μπορεί να μην ανακαλυφθεί η ιδιότητά του, έτσι είναι προτιμητέο να καλλιεργούνται και να εμβολιάζονται στη φυλλική επιφάνεια.

2.10 Η σειρά των διαφόρων δοκιμών και συμπληρωματικά τεστ    [Αρχή]

Για ένα επιτυχημένο σύστημα βιολογικής καταπολέμησης σε διαφορετικά στάδια και πριν αρχίσουν τα πειράματα πρέπει να λάβουμε υπόψη μας προηγούμενα αξιόλογα αποτελέσματα από άλλες εργασίες που αφορούν έρευνα, της φυλλικής επιφάνειας και του εδάφους, τα οποία αποτελούν αυτό που ονομάζουμε πρωτόκολλο βιοδοκιμών. Στη θεωρία η λογικότερη πρόοδος έρχεται προχωρώντας από την “in vitro” μέθοδο (τρυβλία ή τεστ με αντικειμενοφόρους) στην “in vivo” μέθοδο σε ελεγχόμενο περιβάλλον και κατόπιν στην “in vivo” μέθοδο σε μη ελεγχόμενο περιβάλλον. Στην πράξη αυτή η σειρά θεωρείται σαν μια απόλυτη αρχική φόρμουλα που πρέπει να ακολουθείται από όλους τους ερευνητές, εξαιτίας της φτωχής ικανότητας των “in vitro” δοκιμών για πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας των βιολογικών παραγόντων στην πράξη. Προτείνεται αρχικά να γίνονται ταυτόχρονες δοκιμές από την “in vitro” μέθοδο, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, με την “in vivo” μέθοδο με σταγόνες σε μεμονωμένα φύλλα κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες. Κάθε μικροοργανισμός ο οποίος δείχνει σημαντική δράση σε αυτά τα τεστ θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε επόμενο στάδιο. Δεν υπάρχει αξιόλογος τρόπος ούτως ώστε να μπορούμε να προεξοφλήσουμε την επιβίωση του ανταγωνιστή στο φυσικό περιβάλλον των φυτών και του παθογόνου, καθώς οι πληροφορίες σε σχέση με το μικροπεριβάλλον στη φυλλική επιφάνεια δεν αναπαράγονται εύκολα εργαστηριακά.

Εντούτοις υπάρχουν κάποιες βελτιώσεις αυτών των εργαστηριακών δοκιμών που μπορούν να επιτευχθούν χρησιμοποιώντας εμπειρικές προσεγγίσεις, όπως π.χ. ανάπτυξη των ανταγωνιστών σε οριακά υποστρώματα ή μελέτη της ανεκτικότητάς τους σε υπεριώδες φως ή ανάπτυξή τους σε υποστρώματα με περιορισμένο ελεύθερο νερό. Έτσι υποψήφιοι ανταγωνιστές θα μπορούσαν να επιλεχθούν και να βελτιωθούν με χρήση των Gradient plate μεθόδων, οι οποίες παρέχουν πληροφορίες όσον αφορά στη συγκέντρωση ενός επιλεγμένου παράγοντα.

Παρόλα αυτά ο εκάστοτε μελετητής θα πρέπει να εξετάσει κατά πόσο οι συμπληρωματικές πληροφορίες που θα κερδίσει με το να περιλάβει ένα εξειδικευμένο τεστ στην ερευνητική του εργασία αξίζουν την επιπλέον επένδυση χρόνου και κόστους. Γι αυτό λοιπόν θα πρέπει να αποφασίσει εάν οι βιοδοκιμές αυτές αποσκοπούν στην εξέταση:

α. της ανταγωνιστικής ικανότητας (per-se) ενός μικροοργανισμού,

β. στην ικανότητα επιβίωσής του ή τέλος

γ. για τον καθορισμό του τρόπου δράσης του.

Έτσι αυτές οι πληροφορίες κατανοούνται καλύτερα ανασυνδυάζοντας ανάλογα τα τεστ από την “in vitro” με αυτά της “in vivo” κατηγορίας.

Ο συνδυασμός των δύο αποτελεί τη βάση μιας σωστής επιλογής βιολογικών παραγόντων.

Συμπεράσματα     [Αρχή]

Δύο τύποι λαθών, ανάλογα με αυτά που εμφανίζονταν στη στατιστική υπόθεση, υπάρχει περίπτωση να κάνουν οι ερευνητές οι οποίοι αναζητούν μικροοργανισμούς ανταγωνιστές από κάθε κοινότητα: α. ένας αξιόλογος μικροοργανισμός μπορεί να παραληφθεί ή β. ένας ακατάλληλος μικροοργανισμός να κρατηθεί.

Ο σκοπός κάθε διαδικασίας βιοδοκιμών είναι να ελαχιστοποιήσουμε την πιθανότητα να περιπέσουμε σε ένα από αυτά τα δύο λάθη. Για τη μείωση της πιθανότητας απόρριψης αξιόλογων μικροοργανισμών, η οποία είναι η πιο σοβαρή συνέπεια του λάθους, ο ερευνητής πρέπει να δεχτεί την πιθανότητα να κρατήσει κάποιον όχι τόσο ικανό ανταγωνιστή. Το να κρατηθεί ένα μεγάλο ποσοστό υποψηφίων ανταγωνιστών στελεχών τα οποία δεν αγγίζουν το άριστο επιθυμητό αποτέλεσμα είναι ένας συνηθισμένος συμβιβασμός, ο οποίος αντανακλά τα συντηρητικά” προγράμματα ενός τυπικού τρόπου βιοδοκιμών.

Παρόλα αυτά ο αριθμός των ανταγωνιστών που κατά λάθος απορρίπτονται παραμένει άγνωστος και είναι πολύ δύσκολο να εκτιμηθεί. Ιστορικά μεγάλη προσπάθεια έχει γίνει όσον αφορά σε συμβατικά τεστ σε τρυβλία, ούτως ώστε να αυξηθεί η χρησιμότητά τους. Η προσπάθεια θα πρέπει τώρα να προσανατολιστεί στις “in vivo” τεχνικές, ιδίως σε αυτές που γίνονται κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες.

Άρα λοιπόν σκοπός είναι να γίνουν αυτές οι δοκιμές πιο ομοιόμορφες, πιο κατανοητές και κατάλληλες για εφαρμογή σε δοκιμές μεγάλης κλίμακας. Βελτιώσεις που μπορούν να αναφερθούν είναι η χρήση φύλλου “μοντέλου”, στο οποίο θα επικρατούσαν πιο αληθινές συνθήκες από ότι π.χ. σε μια αντικειμενοφόρο με agarose, με αποτέλεσμα να είναι πιο προσιτά και αναπαραγόμενα τα τελικά αποτελέσματα, όταν θα περάσουν σε πειράματα πάνω στη φυλλική επιφάνεια. Σίγουρα πολλά θα μπορούσαν να γίνουν όταν τα πειράματα γίνονταν πάνω σε μεμονωμένα φύλλα. Βέβαια το αρνητικό σε αυτά τα πειράματα είναι ότι είναι πιο χρονοβόρα σε σχέση με τις συμβατές μεθόδους “in vitro”.

Τέλος θα πρέπει να γίνει διαχωρισμός μεταξύ της ανταγωνιστικής δράσης και της δυναμικής του βιολογικού ελέγχου. Αυτό είναι κάτι που πρέπει να ξεκαθαριστεί από εδώ και πέρα. Ένας μικροοργανισμός μπορεί να είναι αξιόλογος ανταγωνιστής κατά τη διάρκεια όλων των αρχικών δοκιμών, αλλά να μην δείχνει καμιά δράση στη φύση, απλά και μόνο γιατί δεν εγκαθίστανται στον ξενιστή. Πως ένας καλός λοιπόν ανταγωνιστής μπορεί να μετατραπεί σε έναν καλό παράγοντα βιολογικής καταπολέμησης; Σε μια τέτοια περίπτωση οι προσπάθειες θα ήταν καλύτερα να επικεντρωθούν στο να βελτιώσουμε την ικανότητα εγκατάστασης του μικροοργανισμού, παρά να ψάξουμε για άλλο υποψήφιο ανταγωνιστή. Η προφανής ασυμφωνία μεταξύ της “in vitro” δράσης του ανταγωνιστή μπορεί να δείχνει απλά διαφορετική ικανότητα επιβίωσης σε δύο περιβάλλοντα.

Άρα η κορυφή όλης αυτής της πυραμίδας θα πρέπει να είναι η μελέτη των περιβαλλοντολογικών συνθηκών επάνω στη φυλλική επιφάνεια, που καθορίζει τελικά και την αποτελεσματικότητα να είναι πολύ καλός εργαστηριακά ανταγωνιστής στη φύση.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ       [Αρχή]

-Creemers, P. 1992. The chemical control of Botrytis cinerea in fruit culture. Proceedings of the Xth Botrytis symposium, Crete, Greece. Pudoc, Wageningen, The Netherlands, p. 242-247.

-Fokkema, N.J. 1991. The phyllosphere as an ecological neglected milieu: A plant pathologists point of view. In Microbial ecology of leaves. Andrew, J.H. and Hirano, S.S. (eds). Springer Verlag, p. 3-18.

-Gullino, L. and Garibaldi, A. 1988. Biological and integrated control of grey mould of grapevine: Results in Italy. European and Mediterranean Plant Protection Organisation Bulletin 18: 9-12.

-Katan, R. 1982. Resistance to 3,5-dichlorophenyl-N-cyclic imide (“dicarboximide”) fungicides in the grey mould pathogen Botrytis cinerea on protected crops. Plant Pathology 31: 133-141.

-Malathrakis, N.E., 1989. Resistance of Botrytis cinerea to dichlofluanid in greenhouse vegetables. Plant Disease 73: 138-141.

-Malathrakis, N.E. and Kritsotaki, O. 1992. Effect of substrate, temperature and time of application on the effectiveness of three antagonistic fungi against Botrytis cinerea. Proceedings of the Xth Botrytis Symposium, Crete, Greece. Pudoc, Wageningen, The Netherlands, p. 187-191.

-Pappas, A. and Elena, K. 1992. Grey mould control where dichlofluanid reduced sensitivity strains of Botrytis cinerea Pers. Occur. Proceedings of the Xth Botrytis Symposium, Crete, Greece. Pudoc, Wageningen, The Netherlands, p. 252-256.

-Jarvis, W.R. 1989. Factors affecting antagonism of cucumber powdery mildew by Stephanoascus flocculosus and S. Rugulosus. Mycological Research 92: 162.

-Cooperative investigations of Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, and North Carolina State University, Department of Plant Pathology, Raleigh. Paper No. 9356 of the Journal Services of the North Carolina Agricultural Research Service.

-A contribution from the college of Agricultural and life sciences, University of Wisconsin-Madison.

-Jarvis, W. 1992. Managing Diseases in Greenhouse. Grop. APS Press, The American Phytological Society, St. Paul, Minnesota, U.S.A.

-Elad, V. 1990. The Greenhouse Ecosystems: Plants Diseases in Greenhouses. Contribution from The Agricultural Research Organization, The Volcan Center Bet Daran, Israel, No 2926-E.

-Ζάχου, Γ. Δημήτριος 1970. Μαθήματα φυτοπαθολογίας, Ι Γενική φυτοπαθολογία.

-Ζάχου, Γ. Δημήτριος 1970. Μαθήματα φυτοπαθολογίας, ΙΙ Ειδική φυτοπαθολογία.

-Goidanich, G. 1969. Φυτοπροστασία IV.

-Γεωργόπουλος, Σ.Γ. 1984. Βασικές γνώσεις φυτοπαθολογίας.

-Goidanich, G. 1966. Φυτοπαθολογία.

-Μαλαθράκης, Ε. Νικόλαος. Φυτοπροστασία Ι.

-Ψαρρός, Ε.Ε. Βιολογική καταπολέμηση των παθογόνων των φυτών.

-Γεωργική Τεχνολογία. 1989. Φυτοπροστασία-Λίπανση. Τεύχος 5.Α. Αθήνα.

-Γεωργική Τεχνολογία. 1991. Αφιέρωμα φυτοπροστασίας. Τεύχος 7. Αθήνα.