TΕΙ Κρήτης
Σχολή Τεχνολογίας Γεωπονίας
Ε.Π.Ε.Α.Ε.Κ 
Πρόγραμμα Συμπληρωματικής Εκπαίδευσης  "Βιολογική Γεωργία" Ενέργεια 3.4.γ


Πασχάλης Λαγαμτζής,
Τεχνολόγος Γεωπόνος,
Μ Μπότσαρη 123, 57100, Κουφάλια, Θεσσαλονίκη,
Τηλ: 0972171484, 091 52064

Πτυχιακή Εργασία : Βιολογική καταπολέμηση των ασθενειών των φυτών με στελέχη βακτηρίων, μυκήτων καθώς και με διάφορα εκχυλίσματα κομπόστ
Πλήρες Κείμενο   (htm format)                                         

Περίληψη

Η συλλογή των ανταγωνιστικών μικροοργανισμών στηρίζει συνολικά όλα τα βιολογικά προγράμ- ματα. Η χρησιμοποίησή τους για τον έλεγχο μυκητολογικών ασθενειών άρχισε περίπου στις αρχές του 20ού αιώνα, που χρησιμοποιήθηκαν ανταγωνιστές μύκητες για την καταπολέμιση σήψεων σε σπορόφυτα κωνοφόρων. Πολύ λίγες, όμως, είναι οι περιπτώσεις που οι ανταγωνιστές μπορούν να εφαρμοστούν σε εμπορικό επίπεδο. Αυτοί δρουν ανταγωνιστικά ως προς την τροφή και το οξυγόνο, με υπερπαρασιτισμό ή μυκητοπαρασιτισμό του ενός μύκητα σε κάποιον άλλο και με την παραγωγή χημικών ουσιών, προϊόντα που εμποδίζουν και πιο σπάνια καταστρέφουν την ανάπτυξη του παθογόνου.

Η βιολογική καταπολέμηση περιλαμβάνει, εκτός από τους ανταγωνιστικούς μικροοργανισμούς, και άτομα ή πληθυσμούς που ανήκουν στο ίδιο παθογόνο είδος αλλά έχουν χαμηλή ή μηδαμινή μολυσματικότητα, την ανθεκτικότητα του φυτού ξενιστή στην προσβολή του παθογόνου και τα εκχυλίσματα από οργανικά υλικά (composts).

Γι’αυτό γίνονται προσπάθειες να εφαρμοστούν μέθοδοι βιολογικής καταπολέμησης που θα εφαρμόζονται είτε χωριστά είτε σε συνδυασμό με άλλα μέτρα καταπολέμησης. Η ηλιοαπολύμανση είναι μια τεχνική καταπολέμησης των παθογόνων του εδάφους και είναι ικανή να αποκαταστήσει τη διαταραγμένη μικροχλωρίδα από τα ισχυρά απολυμαντικά και να βελτιώσει την υφή και τη γονιμότητα των εδαφών.

Η φυτόμαζα εκτός από το ότι εμπλουτίζει το έδαφος με οργανική ουσία, ευνοεί την ανάπτυξη της σαπροφυτικής ανταγωνιστικής μικροχλωρίδας του εδάφους, που περιορίζει πολλές ασθένειες.

Παρόλο που πολλοί από τους τρόπους βιολογικής καταπολέμισης που έχουν δοκιμαστεί σε πειράματα ήταν αρκετά αποτελεσματικοί, στην πράξη χρησιμοποιούνται πολύ λίγοι. Αυτό συμβαίνει γιατί:

α. Οι βιολογικοί παράγοντες είναι συνήθως αποτελεσματικοί εναντίον μόνο μιας ασθένειας ο καθένας.

β. δεν συνδυάζονται πάντα μεταξύ τους και με άλλες μεθόδους, όπως χημικά μέσα, για την καταπολέμηση πολλών ασθενειών συγχρόνως.

γ. το κόστος συχνά είναι μεγαλύτερο από αυτό των συνηθισμένων μεθόδων

δ. ακόμα και όταν υπάρχουν οι καλύτερες συνθήκες η αποτελεσματικότητά τους είναι προς το παρόν κατώτερη από αυτή των άλλων μεθόδων.

ε. στα θερμοκήπια που δεν υπάρχει κλιματισμός οι βιολογικοί παράγοντες δεν είναι αποτελεσματικοί γιατί χρειάζονται συγκεκριμένες συνθήκες περιβάλλοντος

Για να αυξηθεί η αποτελεσματικότητα της χρησιμοποίησης αυτών των παραγόντων πρέπει η έρευνα να συγκεντρώσει το ενδιαφέρον στα εξής σημεία:

α. βελτίωση των γνώσεων όσον αφορά την οικολογία των ανταγωνιστών και παθογόνων.

β. μελέτη του τόπου δράσης των διαφόρων ανταγωνιστών (αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους και με τα παθογόνα ).

γ. καλύτερη γνώση της χλωρίδας των διαφόρων ανταγωνιστών ( το είδος και ο πληθυσμός των διαφόρων μικροοργανισμών στην φυλλόσφαιρα ).

δ. βελτίωση των ανταγωνιστών στελεχών.

ε. βελτίωση της βιομηχανικής παραγωγής των ανταγωνιστών.

Ωστόσο λίγα πειράματα έχουν γίνει με σκοπό να χρησιμοποιηθούν παράσιτα στον έλεγχο κάποιας ασθένειας κάτω από πρακτικές συνθήκες στα θερμοκήπια και στα χωράφια. Ένα από αυτά το Cladosporium sp, έχει αναφερθεί ότι παρασιτεί σε πολλούς μύκητες, όπως αυτούς που προκαλούν τα ωίδια. Δεν έχει ανάφερθεί κανένας περιβαλλοντικός κίνδυνος που να συνδέεται με τη χρήση των υπερπαρασιτικών των μυκήτων που προκαλούν τις ασθένειες ωίδιο και σκωρίαση. Ωστόσο είναι δύσκολο να εφαρμόσουμε στην πράξη τον τρόπο αυτό αντιμετώπισης μιας ασθένειας.

Τρεις διαφορετικοί οργανισμοί εμπλέκονται: Τα φυτά που φιλοξενούν παράσιτα, οι παθογόνοι οργανισμοί και ο υπερπαρασιτικός μύκητας. Ο καθένας επηρεάζεται από το περιβάλλον, τις καλλιεργητικές τεχνικές και τα προγράμματα καταπολέμησης των ασθενειών αυτών.

Η διασπορά των μυκήτων όπως το Cladosporium herbarum και Cladosporium Cladosporoidoides που παράγουν μεγάλους αριθμούς κονιδίων γίνεται με τον αέρα. Ως εκ τούτου τα κονίδια τους συγκεντρώνονται στις εναέριες επιφάνειες των φυτών, όπου ειδικά πολλά στελέχη του γένους Cladosporium sp, έχουν παρατηρηθεί. Κατά τη διάρκεια της περιόδου που τα κονίδια βρίσκονται στις εναέριες επιφάνειες του φυτού είναι εκτεθειμένα σε ένα συνεχώς μεταβαλλόμενο περιβάλλον που χαρακτηρίζεται από τις συνεχείς διακυμάνσεις υγρασίας, θερμοκρασίας και ηλιακής ακτινοβολίας. Η χαμηλή υγρασία είναι ο πιο σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει τη βλάστηση και την ανάπτυξη. Και τα δύο είδη μπορούν να παράγουν υφές σκουρόχρωμες και με παχιά τοιχώματα, που τους επιτρέπουν να αντιστέκονται στην υπερβολική ακτινοβολία και θερμοκρασία. Οι μύκητες αυτοί διεισδύουν σε ζωντανούς ιστούς φυτών κυρίως μέσω των στοματίων, ή μεγαλώνουν κοντά στα στομάτια χωρίς να κάνουν κάποια προσπάθεια να διεισδύσουν στο φύλλο. Άλλες εστίες μόλυνσης που αυτοί οι μύκητες εκμεταλλεύονται είναι οι φυσικές και τεχνικές πληγές.

Οι δύο μύκητες (Cladosporium sp και Alternarium alternata) αποικίζουν τα έλυτρα των δημητριακών και αποτελούν τους κύριους μύκητες που προκαλούν την καπνιά η οποία οφείλεται στους κονιδιοφόρους και τα κονίδια.

Οι απομονώσεις και η συλλογή των μυκήτων αυτών και των βακτηρίων γίνονται με λεπτομέρειες και καταγράφονται, η ημέρα συλλογής, η αφθονία των βακτηρίων (συγκέντρωση), το μέσο απομόνωσης και η μέθοδος διατήρησης.

Η πρώτη σημαντική ερώτηση είναι κατά πόσο πρέπει να απομονωθούν αντιπροσωπευτικά είδη από ολόκληρη τη μικροβιακή κοινότητα ή είδη με εξειδικευμένες απαιτήσεις.

α. Στην πρώτη περίπτωση η απομόνωση πρέπει να γίνει σε υποστρώματα κατάλληλα για νυματόμορφους μύκητες, ζύμες και βακτήρια.

β. Στη δεύτερη περίπτωση η διαδικασία επιλογής βασίζεται στα θρεπτικά χαρακτηριστικά των μικροοργανισμών με τη χρήση κάποιου συστατικού που υποβοηθεί την ανάπτυξη συγκεκριμένων μικροοργανισμών (χιτίνη, agar για τους ακτινομύκητες).

γ. Μια επιλογή είναι να καλλιεργήσουμε στο ίδιο τρυβλίο με agar το παθογόνο και τους υποψήφιους ανταγωνιστές και μετά να επιλέξουμε τους μικροοργανισμούς που δείχνουν ανταγωνιστική δράση, όπως αυτό κρίνεται από ζώνες παρεμπόδισης.

δ. Μερικοί ερευνητές προτιμούν να δοκιμάζουν μικροοργανισμούς με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά, όπως την παρουσία τους στην φυλλική επιφάνεια, καλή ανάπτυξη, σταθερότητα και ικανότητα σποροποίησης σε καλλιέργεια in vitro, ιδίως όταν ξέρουμε ότι τα μέλη των γενών ή των ειδών αυτών είναι ανταγωνιστές.

Στην πράξη καμμιά από τις παραπάνω υποθέσεις δεν έχει επιβεβαιωθεί στη μικροβιολογική μελέτη της φυλλικής επιφάνειας. Άλλο ένα ερώτημα εξίσου σημαντικό είναι πως θα καθαρίσουμε και θα αποθηκεύσουμε τους μικροοργανισμούς άγρια στελέχη που έχουν απομονωθεί από την φυλλική επιφάνεια. Αυτό είναι ένα πρόβλημα που πρέπει να λύσουμε όσο το δυνατόν καλύτερα, γιατί πρέπει η καλλιέργεια να παραμείνει γενετικά αμετάβλητη.

Τα βακτήρια και οι ζύμες πρέπει να περάσουν από διαδοχικές καλλιέργειες (τρεις ως τέσσερις φορές) με απομόνωση μεμονωμένων αποικιών.

Οι ακτινομύκητες καθαρίζονται με διαδοχικές αραιώσεις, το αιώρημα των οποίων απλώνεται σε τρυβλία. Οι μύκητες οι οποίοι θα επιλεγούν πρέπει να προέρχονται από μονόσπορη καλλιέργεια ή κομμάτια υφής και όχι από μαζικές μεταφυτεύσεις. Οι πιο κατάλληλες μέθοδοι για μακροχρόνια διατήρηση είναι η αποθήκευση σε υγρό άζωτο, η αποθήκευση στους –700C σε γλυκερόλη ή διμεθυλική σουλφοξίδη ή άλλα κρυοπροστατευτικά ή ακόμη για μερικούς μύκητες πάγωμα (κατάψυξη) κάτω από λάδι στο ψυγείο.

Για αποτελεσματική βιολογική καταπολέμηση οι ανταγωνιστές πρέπει να έχουν ανταγωνιστική ικανότητα και ικανότητα για την επιβίωσή τους στο οικοσύστημα. Οι βιοδοκιμές που βασίζονται στην παραπάνω αρχή εξετάζονται στο εργαστήριο με α) μακροσκοπική εξέταση κολλητικής ταινίας που έχει χρησιμοποιηθεί για αποτυπώσεις κατευθείαν από τα φύλλα, β) σε υποστρώματα με βάση το agar και γ) σε αντικειμενοφόρους πλάκες με τη χρήση μικροσκοπίου. Η αποτελεσματικότητα ως βιολογικός παράγοντας μπορεί να εκτιμηθεί με τη μείωση της προσβολής ή με τη καταγραφή της έντασης, όπως αριθμός κηλίδων και εμβαδόν των κηλίδων, ή με μέτρηση του εμβαδού χαμένης φυλλικής επιφάνειας ορισμένης φυτικής βιομάζας.

Έτσι εφαρμόζονται σήμερα:

α. η μέθοδος in vivo με δοκιμές που γίνονται με φυτά σε θαλαμούς ανάπτυξης, κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες

β. η μέθοδος σε αντικειμενοφόρους με agar (agar slides) (αντικειμενοφόροι μικροσκοπίου καλυμμένες με λεπτή στρωση agar ή agaroses).

γ. Μέθοδος in vitro με πειράματα σε τρυβλία με agar στερεά υποστρώματα ή παραλλαγές αυτού του τύπου δοκιμής ή τοπική εμφύτευση σε τρυβλία και

δ. Δοκιμές σε φυτά κάτω από μη ελεγχόμενες συνθήκες (το πως ο ανταγωνιστής δρα όταν εφαρμόζεται σε φυσικό περιβάλλον) το οποίο περιλαμβάνει φυσικά και αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες. Δεν προκαλεί έκπληξη ότι πολλοί ανταγωνιστές δεν περνούν την τελική αυτή δοκιμή.

Στη θεωρία η λογικότερη πρόοδος έρχεται προχωρώντας από την in vitro μέθοδο στην in vivo μέθοδο σε ελεγχόμενο περιβάλλον και κατόπιν στην in vivo μέθοδο σε μη ελεγχόμενο περιβάλλον. Στην πράξη αυτή η σειρά θεωρείται σαν μια απόλυτη αρχική φόρμουλα που πρέπει να ακολουθείται από όλους τους ερευνητές,εξ’αιτίας της φτωχής ικανότητας των in vitro δοκιμών.

Προτείνεται αρχικά να γίνονται ταυτόχρονες δοκιμές από την in vitro μέθοδο,με την in vivo μέθοδο. Κάθε μικροοργανισμός ο οποίος δείχνει σημαντική δράση σε αυτά τα test θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε επόμενο στάδιο. Γι’αυτό λοιπόν οι βιοδοκιμές εκτός από όλα αυτά που αναφέρθηκαν,θα πρέπει να αποφασιστεί για το εάν αποσκοπούν στην εξέταση:

α. της ανταγωνιστικής ικανότητας ενός μικροοργανισμού

β. στην ικανότητα επιβίωσης του ή τέλος

γ. για τον καθορισμό του τρόπου δράσης του

Δύο τύποι λαθών, υπάρχει περίπτωση να κάνουν οι ερευνητές οι οποίοι αναζητούν μικροργανισμούς αναγωνιστές από κάθε κοινότητα: α. ένας αξιόλογος μικροοργανισμός μπορεί να παραληφθεί ή β. ένας ακατάλληλος μικροοργανισμός να κρατηθεί. Ο σκοπός κάθε διαδικασίας βιοδοκιμών είναι να ελαχιστοποιήσουμε την πιθανότητα να περιπέσουμε σε ένα άπο αύτα τα δύο λάθη. Τέλος θα πρέπει να γίνει διαχωρισμός μεταξύ της ανταγωνιστικής δράσης και της δυναμικής του βιολογικού ελέγχου. Ένας μικροοργανισμός μπορεί να είναι αξιόλογος ανταγωνιστής κατά τη διάρκεια όλων των αρχικών δοκιμών, αλλά να μη δείχνει καμιά δράση στη φύση, απλά και μόνο γιατί δεν εγκαθίστανται στον ξενιστή. Άρα η κορυφή όλης αυτής της πυραμίδας θα πρέπει να είναι η μελέτη των περιβαλλοντικών συνθηκών επάνω στη φυλλική επιφάνεια,που καθορίζει τελικά και την αποτελεσματικότητα να είναι πολύ καλός εργαστηριακά ανταγωνιστής στη φύση.